Hiển vi huỳnh quang thông thường quan sát các mẫu được nhuộm có lựa chọn bằng các phân tử phát quang hoặc sử dụng liên kết kháng thể hoặc dùng các protein phát quang. Nói chung, mật độ chất phát quang cao sẽ giúp ảnh huỳnh quang có độ tương phản tốt hơn.

Đơn hạt phát quang có thể nhìn thấy bằng kính hiển vi (hoặc thậm chí bằng mắt thường[8]) nếu số photon phát ra đủ lớn và nhiễu nền đủ nhỏ. Ảnh 2D của một nguồn sáng điểm quan sát bằng kính hiển vi là một chấm có kích thước bị mở rộng tương ứng với đĩa Airy (một lát cắt của hàm mở rộng điểm PFS - Point Spead Function) của hệ tạo ảnh.Sự mở rộng này giới hạn khả năng phát hiện hại phân tử phát quang ở gần nhau. Tiêu chuẩn Abbe xác định khoảng cách nhỏ nhất giữa hai nguồn sáng điểm có thể còn phân biệt được

d = λ 2 N A {\displaystyle d={\frac {\lambda }{2NA}}}

trong đó λ {\displaystyle \lambda } là bước sóng của ánh sáng huỳnh quang NA là khẩu độ số (numerical aperture) của vật kính. Theo lý thuyết, với bước sóng 400 nm, vật kính có khẩu độ số 1,40, giới hạn phân giải ngang là 150 nm, phân giải dọc là 400 nm.

Tuy nhiên, nếu phân biệt được hai phân tử phát quang gần nhau, chúng ta có thể vượt qua giới hạn nhiễu xạ.[9] Khi các photon phát ra từ một phân tử được ghi nhận, chúng sẽ tạo ra một chấm nhiễu xạ trên mặt phẳng ảnh của kính hiển vi. Tâm của chấm này có thể xác định được bằng cách fit mặt bao của nó với một hàm đã biết, thường là hàm Gauss hai chiều. Sai số trong việc xác định tâm phát xạ tỉ lệ nghịch với căn bậc hai của số photon ghi nhận được. Nếu số photon ghi nhận đủ lớn, sai số định vị nhỏ hơn nhiều so với hàm mở rộng điểm của hệ.

Các hạt phát quang gần nhau nên không thể phân biệt được từng hạt. Vị trí của hạt có thể xác định được khi các photon phát ra từ mỗi hạt không bị trùng chập với các photon phát ra từ hạt gần nó.

Hai bước nhận biết và định vị các phân tử phát quang đơn lẻ là thao tác cơ bản của PALM, STORM và các phát triển từ chúng.

Mặc dù có nhiều cách nhận biết phân tử, phương pháp điều khiển sự phát quang của phân tử bằng ánh sáng được sử dụng rộng rãi nhất. Một phần nhỏ các phân tử phát quang được bật một cách ngẫu nhiên bằng ánh sáng thích hợp sao cho mật độ của chúng đủ nhỏ để ảnh huỳnh quang của các phân tử không bị chồng chập. Sau đó các phân tử riêng lẻ được kích thích và ảnh của chúng được ghi lại. Các phân tử này sau đó bị tẩy quang (photobleaching) như trong phương pháp PALM, hoặc chuyển về trạng thái không phát quang như trong phương pháp STORM. Quy trình này được lặp lại nhiều lần. Như vậy, một chuỗi ảnh của các phân tử phát quang rời rạc sẽ được thu lại.

Quang kích hoạt, định vị, tẩy quangMột khung hình của camera CCD chụp ảnh các protein phát quang riêng lẻ được kích thích ở chế độ phản xạ nội toàn phầnChuỗi các khung hình chụp các đơn phân tử phát quang

Định vị từng phân tử

Với mỗi ảnh trong chuỗi, vị trí của hạt phát quang được xác định với độ chính xác tốt hơn so với giới hạn nhiễu xạ - thường từ vài đến vài chục nm. Các thông tin về vị trí tâm của các phân tử phát quang đã được định vị sẽ được sử dụng để dựng ảnh huỳnh quang siêu phân giải.

Độ chính xác của phép định vị được xác định theo công thức:

σ = ( s i 2 + a 2 12 N ) ⋅ ( 16 9 + 4 τ s i 2 b 2 a 2 N ) {\displaystyle \sigma ={\sqrt {\left({\frac {s_{i}^{2}+{\frac {a^{2}}{12}}}{N}}\right)\cdot \left({\frac {16}{9}}+{\frac {4\tau s_{i}^{2}b^{2}}{a^{2}N}}\right)}}}

trong đó N là số photon ghi nhận, a là kích thước pixel của camera, b 2 {\displaystyle b^{2}} trung bình của nhiễu nền và s i {\displaystyle s_{i}} là độ lệch chuẩn của hàm mở rộng điểm.[10]

Để tăng tỉ số tín hiệu trên nhiễu, do đó tăng độ chính xác của phép định vị, các cấu hình hiển vi thường được sử dụng là hiển vị huỳnh quang phản xạ nội toàn phần (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope - TIRF) and hiển vi huỳnh quang chiếu lát (Light sheet fluorescence microscope).